MTT法

甲基叔丁基醚，一种黄色四唑，在活细胞中被还原成紫色甲^[1]。通常会加入一些溶解性好的溶剂来溶解不溶性物质甲臜，从而形成有色溶液（这些试剂主要是是二甲基亚砜、酸化乙醇溶液或洗涤剂十二烷基硫酸钠在稀盐酸中的溶液）。这种有色溶液的吸光度可以通过分光光度计在一定波长(通常在500和600纳米之间)下测量来定量。吸光度取决于溶剂浓度。

XTT (2，3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-苯胺)已被提议取代MTT，它可以产生更高的灵敏度和更高的动态范围。形成的甲臜染料是水溶性的，避免了最后的溶解步骤^[2]。

水溶性四唑𬭩盐是MTT的最新替代品:它们是通过在四唑𬭩盐的苯环上引入正电荷或负电荷以及羟基而开发出来的，或者更好的是在苯环上直接或间接引入磺酸盐基团。

MTS (3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑𬭩)，在吩嗪甲氧基硫酸盐(PMS)的存在下，产生甲瓒产物，其在磷酸盐缓冲盐水中的最大吸光度为490 nm。MTS试验通常被描述为“一步”MTT试验，它提供了将试剂直接添加到细胞培养物中的便利，而无需MTT试验中所需的间歇步骤。然而，这种便利性使得MTS检测容易受到色度干扰，因为MTT检测中的间歇步骤去除了痕量有色化合物，而这些化合物在一步MTS检测中保留在微量滴定板中。使用该分析时，需要采取预防措施以确保准确性，并且有强有力的论据支持使用显微镜下的定性观察来确认中期战略结果。(然而，这对于所有颜色测定是谨慎的。)^[3]

水溶性四唑盐(WSTs)是一系列用于MTT分析的其他水溶性染料，它们可以形成具有不同吸收光谱的甲瓒^[4]。WST-1，特别是WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二氟苯基)-2H-四唑𬭩)的使用都优于MTT，因为它们在细胞外被还原，与PMS电子介体结合，并产生水溶性甲臜。最后，WST分析(1)可以直接读取(不同于需要增溶步骤的MTT)，(2)给出比MTT更有效的信号，以及(3)降低对细胞的毒性(不同于细胞可渗透的MTT，以及其在细胞内积累的不溶性甲臜)^[4]。

四唑𬭩染料的还原通常被认为主要取决于细胞胞质中的NAD(P)H依赖性氧化还原酶^[5][5] 。因此，甲基叔丁基醚和其他四唑𬭩染料的还原取决于由NAD(磷)氢通量引起的细胞代谢活性。新陈代谢低的细胞，如胸腺细胞和脾细胞，还原的MTT很少。相反，快速分裂的细胞表现出较高的MTT还原性。重要的是要记住，实验条件变化可以改变代谢活性，从而减少四唑𬭩染料，而不影响细胞活力。此外，MTT的还原机理，主要取决于产物的量，不管是细胞内生成的MTT,MTS还是细胞外的WST-1。还有就是，有时MTT的还原并不涉及酶催化过程，例如脂质细胞这种情况。^[3]然而，尽管存在多种代替品，但MTT仍然是一种广泛评估细胞还原能力的一种方法(即还原化合物驱动细胞能量学的有效性)^[6] 。因此，最终的细胞存活率的解释仍保持不变。